¿Qué es una PCR?

La PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa, es una técnica de biología molecular creada en el año 1986 por Kary Mullis.
Esta técnica consiste en obtener una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN de manera específica utilizando una enzima* llamada ADN Polimerasa, con la cual se logra amplificar la señal de este trozo de secuencia genética, por lo que es utilizado para identificar virus, bacterias, personas, etc.
*Una enzima es principalmente una proteína que favorece y regula reacciones químicas en los seres vivos.

¿Cómo funciona una PCR?

Es un proceso cíclico, que consiste de tres elementos:

1. Denaturación.

EL ADN con doble hebra se denatura, es decir, se separan sus dos hebras mediante altas temperaturas (a 94-95 °C).

2. Alineamiento.

Los partidores (secuencias pequeñas de ADN) se alinean por complementariedad de bases al templado, es decir, si en el templado (hebra de ADN separada en el paso anterior) está esta secuencia ACTGGTCA, la secuencia del partidor debiese ser, TGACCAGT, que es la secuencia complementaria. La temperatura usada es de suma importancia y se denomina Tm o temperatura de alineamiento (Puedes calcularla en nuestra calculadora de Tm).

3. Extensión.

Luego del alineamiento se comienza a sintetizar una nueva hebra de ADN por acción de la ADN Polimerasa. Por lo tanto al final de la PCR tendremos múltiples copias de ADN provenientes de 1 sola copia de ADN.

Todo este procedimiento ocurre dentro de un equipo llamado termociclador, el cual como su nombre lo dice hace ciclos de temperatura. La variación de la temperatura activa o inactiva las diferentes enzimas y componentes, que se traducen en los 3 pasos mencionados.

Para que puedan comprender más fácilmente este proceso, pueden ver la siguiente infografía, ya que para todos siempre es más fácil comprender viendo como realmente ocurre una situación, que sólo leyéndola.

Sin embargo, el virus SARS-CoV-2 no tiene ADN en su estructura, tiene ARN de una sola hebra, entonces ¿cómo la PCR puede detectar el virus?

Debido a la contingencia a nivel mundial, se ha utilizado la PCR para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en pacientes sintomáticos para la enfermedad de COVID-19 o más conocido como coronavirus. Cabe destacar que los síntomas más recurrentes a nivel mundial son dolor de garganta, tos y fiebre, sin embargo en Chile los síntomas que prevalecen son diferentes, se destacan: cefalea (dolor de cabeza), disnea (dificultad para respirar) y tos.

Pero ¿Qué es el COVID-19?

El COVID-19, es la enfermedad causada por el virus SARS-CoV-2, una cepa de la familia de virus coronavirus, que hasta el momento (Abril de 2020) no tiene vacuna. El SARS-CoV-2 es un virus con envoltura, una sola cadena de ARN de sentido positivo (+ssRNA), tiene un diámetro de 100-160m y tiene 26-32 kb de tamaño.

A pesar de que el SARS-CoV-2 es una cepa, ésta además posee diversas variantes de las cuales a nivel mundial ya se han detectado más de 40 diferentes. En Chile ya se ha logrado detectar la presencia de dos variantes distintas, pero de las cuales no se ha determinado si existen diferencias sintomatológicas o de otra índole.

¿Cómo se contagia el COVID-19?

Cuando el virus ya ha infectado tu cuerpo, va a comenzar a replicarse (multiplicarse) y a salir pequeños virus de cada una de tus células infectadas, esto provoca distintos síntomas, como tos, lo que provoca que al toser expulses microgotas (gotas muy pequeñitas, algunas imperceptibles) que llevan el virus SARS-CoV-2 y que si caen en alguna superficie podrían infectar a más personas.

Por ejemplo, podrian caer tus microgotas de la tos en el ojo de una persona, la boca o la nariz, lo que al estar el virus en contacto con la mucosa de esa persona, lograrán infectar las células de esa persona, ingresando a su célula y posteriormente seguir su ciclo infectivo (ve la imagen inferior para que comprendas mejor).

Ahora, si tus microgotas caen en una superficie como un pilar del metro (donde se afirman las personas), los virus podrían permanecer durante 48-50 horas en ese lugar, lo que conlleva a que si una persona se afirma en ese pilar luego con su mano se rasca el ojo o se toca la boca o nariz, puede contagiarse, ya que el pilar actúa como vector, es decir, el pilar contiene virus y los mantiene ahí.

Ciclo replicativo de SARS-CoV-2.

(1) El virus SARS-CoV-2 presenta en su envoltura la glicoproteína S, la cual interacciona con el receptor ACE2 de la célula humana. Esto produce que el virus ingrese a la célula por endocitosis, quedando el virus dentro del endosoma. El pH del endosoma se vuelve más ácido debido a los lisosomas que promueven la fusión de la membrana del endosoma con la del virus.
(2) Este hecho provoca la exposición de la nucleocápside del virus que es degradada por proteasas de la célula, liberando el material genético (ARN) del virus.
(3) Luego se produce la traducción directa del ARN por medio del ribosoma de la célula, ya que el ARN viral es de sentido positivo.
(4) La traducción resulta en poliproteínas que son proteolizadas, es decir, cortadas. Las proteínas virales forman el complejo de replicación y transcripción viral.
(5) Por un lado, se produce la replicación del genoma viral. (5′) Por otra parte, se produce la traducción del ARN que dará origen a proteínas virales que son expresadas por el retículo endoplasmático.
(6) Luego se producirá el ensamblaje del virus con el ARN y proteínas virales, envueltas en la membrana del retículo. Mediante el transporte de vesículas mediada por el aparato de Golgi, llegará a la superficie de la membrana plasmática celular.
(7) El virus es liberado de la célula por exocitosis.
(8) Finalmente se produce la maduración del virus mediante proteasas virales que permiten el correcto encaje del virus.
Infografía basada en: Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D. & Munster, V. (2016). SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses, Nat Rev Microbiol, 14(8):523-34, DOI: 10.1038/nrmicro.2016.81; Asencio, V. (2020) Ciclo de coronavirus SARS-CoV-2. CC by-SA 4.0.

 

¿Cómo puede actuar un objeto como vector?

Esto ocurre debido a que el virus permanece intacto, es decir, con su envoltura y material genético sin degradar durante un tiempo hasta que luego, por aire, luz, etc., se desestabiliza y desintegra. Existen diversas superficies en que el virus permanece estable por tiempos diferentes, como se muestra en la siguiente tabla.

Tabla 1. Tiempo de viabilidad de SARS-CoV-2 en diversas superficies.

Tiempo de viabilidad se refiere al tiempo en que el virus deja de ser estable e integro para poder infectar. Basada en Figura 1 de: van Doremalen, N., Morris, D., Holbrook, M., Gamble, A., Williamson, B., Tamin, A., Harcourt, J., . Thornburg, N., Gerber, S., Lloyd-Smith, J., de Wit, E. & Munster, V. (2020). Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1, The new england journal o f medicine, DOI: 10.1056/NEJMc2004973.

¿Cómo es posible que la PCR detecte el virus si el SARS-CoV-2 es un virus con ARN?

Esto se debe a que existe una enzima. llamada Transcritasa Reversa, la cual sintetiza ADN a partir de ARN, con lo cual a nuestra PCR antes descrita en la imagen, debemos agregar un paso anterior en donde se encuentra el ARN del virus junto con la enzima Transcriptasa Reversa y que posteriormente sintetiza ADN, pero este ADN es complementario ya que es la hebra complementaria la que sintetizaría esta enzima. Una vez con nuestro ADN, procedemos a realizar nuestra PCR.

Lo que debes saber también, es que además los países estan utilizando una «actualización» de la PCR que permite una mavor sensibilidad sin tener que realizar otros procedimientos para contabilizar la carga viral, esta técnica se llama qPCR (la q proviene de quantitative) y es la misma PCR pero que puede cuantificarse en tiempo real. Para esto, se utilizan partidores pero que poseen un fluoróforo que a través de un termociclador especializado pueden contabilizar automáticamente la cantidad de amplificados de PCR.
Por lo tanto la técnica suele llamarse RT-qPCR, RT por la acción de la Transcriptasa Reversa de obtener ADN desde ARN, q por la cuantificación automática del fluoróforo y PCR por la amplificación del ADN mediante la Polimerasa.

Entonces, para resumir y que comprendan de manera mas sencilla, les presentamos la siguiente infografía en la cual se describe desde la toma de muestra del paciente hasta la obtención de resultados para el SARS-CoV-2.

Finalmente a todos los científicos y científicas, les compartimos el protocolo para la detección del SARS-CoV-2 de la OMS. Sólo haz clic en el botón de abajo y te redirigirá al protocolo en PDF, listo para imprimir.
DESCARGAR PROTOCOLO

Esperamos de corazón que les haya gustado este articulo y sobretodo que les haya servido para comprender la detección de SARS-CoV-2 mediante PCR y que hayan podido explicar de mejor manera a las personas que les preguntan como funciona esta técnica.

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